蛋白免疫印跡（Western blotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測(cè)三個(gè)部分組成。第一步是通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)混合物按分子量大小在凝膠中分成條帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，使用較多的是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移。第三步是用特異性的抗體檢測(cè)出已經(jīng)印跡在膜上的目標(biāo)抗原。免疫檢測(cè)的方法可以是直接的和間接的。現(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體(堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)中。

 

一、操作步驟：

 

1. 蛋白樣品制備

 

（1）單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：

 

①倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

 

②每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1 min 洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

 

③按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）

 

④每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。

 

⑤裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml 離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）

 

⑥于4℃下12000 rpm離心5 min 。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）

 

⑦將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 min 的離心管中放于-20℃保存。

 

（2）組織中總蛋白的提取：

 

①將少量組織塊置于1～2 ml 勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

 

②加400 ml單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。

 

③幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。

 

④裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml 離心管中，然后在4℃下12000 rpm 離心5 min ，取上清分裝于0.5 ml 離心管中并置于-20℃保存。

 

（3）加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：

 

由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按（1）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：

 

①將培養(yǎng)液倒至1.5 ml 離心管中，于2500 rpm 離心5 min。

 

②棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm 離心5 min 。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

 

③用槍洗干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

 

④將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm 離心5 min，取上清分裝于0.5 ml 離心管中并置于-20℃保存。

 

2. 蛋白含量的測(cè)定

 

（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

 

①?gòu)?20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。

 

②取18個(gè)1.5 ml 離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為 0 μg，2.5 μg，5.0 μg ，10.0 μg ，20.0 μg ，40.0μg。

 

③按下表在各管中加入各種試劑。

 

0 μg 2.5 μg 5.0 μg 10.0 μg 20.0 μg 40.0 μg

1mg/ml BSA —— 2.5 μl 5.0 μl 10.0 μl 20.0 μl 40.0 μl

0.15mol/L NaCl 100 μl 97.5 μl 95.0 μl 90.0 μl 80.0 μl 60.0 μl

G250考馬斯亮藍(lán)溶液 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

 

④混勻后，室溫放置2 min 。在生物分光光度計(jì)（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。

 

（2）檢測(cè)樣品蛋白含量

 

①取足量的1.5 ml 離心管，每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml 。室溫放置30 min后即可用于測(cè)蛋白。

 

②取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 μl，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測(cè)空白樣品。

 

③棄空白樣品，用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 ml），再用無(wú)菌水洗一次。

 

④取一管考馬斯亮藍(lán)加95 μl 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 μl待測(cè)蛋白樣品，混勻后靜置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測(cè)樣品。

 

注意：每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無(wú)水乙醇洗2次，無(wú)菌水洗一次。可同時(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè)，這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是5 μl樣品含的蛋白量。

 

3. SDS－PAGE電泳

 

（1）清洗玻璃板：

 

一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。

 

（2）灌膠與上樣

 

①玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。）

 

②按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10 ml 槍吸取5 ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）

 

③當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3 min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

 

④按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

 

⑤用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）

 

⑥測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml 離心管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 μl，加樣孔的最大限度可加20 μl樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。

 

⑦加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。

 

（3）電泳

電泳時(shí)間一般4～5 h，電壓為40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

 

4. 轉(zhuǎn)膜

 

（1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。

 

（2）在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。

 

（3）將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），

一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。

 

（4）要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。）

 

（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。

 

（6）轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。   

 

5. 免疫反應(yīng)

 

（1）將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。

 

（2）將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5 ml 離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。

 

（3）同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

 

6. 化學(xué)發(fā)光，顯影，定影

 

（1）將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。

 

（2）在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大小（比膜的長(zhǎng)和寬均需大1 cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為1～2 min（20～25℃），溫度過低時(shí)（低于16℃）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10 min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。

 

應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

 

7. 凝膠圖象分析

將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。